JIP-test熒光參數(shù)PCA分析實操
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植物材料&處理方法(Material andmethods)
選用紫薇（Lagerstroemia indica Linn.）長勢均勻、朝向一致的成熟葉，60℃熱水分別浸沒0s、10s、30s和60s熱脅迫處理。
快速葉綠素熒光誘導動力學曲線(OJIP polyphasic chlorophyll Chl a fluorescence rise kinetics)
使用Handy PEA(Hansatech Instruments Ltd., Norfolk, UK)測定，時長2s，光強3000 μmol·m–2·s–1。測定前所有樣品由暗適應夾遮光處理30min。依據(jù)JIP-test能量流動模型理論(Strasser et al. 2004)熒光參數(shù)由PEA Plus軟件直接計算并導出。
根據(jù)Springer Nature 2018出版的《Advances in Plant Ecophysiology Techniques》歸類總結的熱脅迫對快速Chl熒光(OJIP)參數(shù)的影響(點擊這里閱讀此文)選擇相應敏感參數(shù)進行PCA分析，所選JIP-test熒光參數(shù)介紹詳見文末附表1。
數(shù)據(jù)分析軟件(Statistical analysis)
數(shù)據(jù)PCA分析處理及作圖分別使用IBM SPSS Statistics 26(IBM Corp)和Excel 2016(Microsoft Corp)。
操作步驟(Operation Steps)
一、 原始數(shù)據(jù)的導出&預處理
樣品測定結束后，通過PEA Plus軟件對樣品數(shù)據(jù)進行分組預處理、導出并標準化處理OJIP曲線和導出JIP-test熒光參數(shù)，詳細操作方法點擊這里查看視頻教程。
二、PCA主成分分析操作步驟
1. 將JIP-test熒光數(shù)據(jù)導入SPSS軟件后，如上圖點擊工具欄“分析”→“降維”→“因子”，彈出PCA分析設置對話框。
2. 如下圖，將選定的需要進行PCA分析的JIP-test熒光參數(shù)導入至“變量”欄中。
3. 點擊“描述”，選中“KMO和巴特利特球形度檢驗”：使用主成分分析進行信息濃縮研究，首先應分析研究數(shù)據(jù)是否適合進行主成分分析。
(i)分析KMO值：如果此值高于0.8，則說明所選數(shù)據(jù)非常適合進行PCA分析；如果此值介于0.7~0.8之間，則說明比較適合進行PCA分析；如果此值介于0.6~0.7，則說明可以進行PCA分析；如果此值小于0.6，說明不適合進行PCA分析；
(ii)如果Bartlett檢驗對應p值小于0.05也說明適合進行主成分分析。
4. 點擊“提取”，選擇顯示“碎石圖”，提取“因子的固定數(shù)目”為2。
碎石圖用于輔助判斷主成分提取個數(shù)，當折線由陡峭突然變得平穩(wěn)時，陡峭到平穩(wěn)對應的主成分個數(shù)即為參考提取主成分個數(shù)。
碎石圖僅輔助決策主成分個數(shù)，實際研究中更多以專業(yè)知識，結合主成分與研究項對應關系情況，綜合權衡判斷得出主成分個數(shù)，此處我們選擇提取的主成分個數(shù)即“因子的固定數(shù)目”為2。
5. 點擊“旋轉”，選擇旋轉方法為“最大方差法”，并選擇顯示“載荷圖”。
使用最大方差法使得降維后同一緯度的方差最大且不同維度之間的相關性為0，而載荷圖用于展示各成分與載荷值關系情況或各成分再不同維度上的分布情況。
6. 點擊“得分”，選擇因子得分"保存為變量"，并“顯示因子得分系數(shù)矩陣”
通過因子得分系數(shù)，分析出各JIP-test熒光參數(shù)與各主成分因子(PC1&PC2)的對應關系或相關性情況。7. 點擊“選項”，選擇系數(shù)顯示格式“禁止顯示小系數(shù)”且絕對值為0。設置絕對值為0可顯示全部因子得分系數(shù)，可用于后續(xù)聚類分析處理。8. 點擊“確定”即可得出PCA分析結果。
三、PCA主成分分析結果查驗
1. 彈出PCA分析結果查看器后，首先如下圖查看“KMO值”(＞0.6)和“巴特利特球形度檢驗顯著性p值”(＜0.05)是否符合PCA分析要求。
2. 查看PCA提取因子PC1&PC2對所有參數(shù)的提取分離度，如下圖PC1和PC2對所有參與分析參數(shù)的累積分離度分別為59.643%和32.042%，PC1&PC2共同的累積分離度為91.685%，表明經(jīng)PCA處理分析得到的兩個成分因子可對所選參數(shù)有極佳的分離描述度。同時通過“碎石圖”可更直觀的查看各成分因子(PC1、PC2...)對參數(shù)的累計分離度。
3. 初步預覽所選JIP-test參數(shù)“旋轉后的成分矩陣”以及在由PC1&PC2組成的二維平面上的分布情況。該成分矩陣表用于后期參數(shù)分布圖的制圖。
4. 返回“數(shù)據(jù)編輯器”預覽經(jīng)PCA分析后新生成保存的各樣品“主成分因子得分表"，表明各樣品在PC1&PC2的得分情況，該得分表用于后續(xù)所有測定樣品的聚類分析。
四、PCA主成分分析結果的可視化操作
n 聚類分析——樣品和JIP-test參數(shù)主成分聚類分析的可視化
將所有樣品“主成分因子得分表”和JIP-test參數(shù)“旋轉后的成分矩陣”復制至新建Excel表中。
1. 選中同一處理組樣品的PC1&PC2得分，點擊”插入“→”散點圖“。
2. 在新生成散點圖處，點擊鼠標右鍵→點擊”選擇數(shù)據(jù)“→分別設置各處理組系列名稱及X軸、Y軸對應數(shù)據(jù)，詳細操作見下方視頻。
3. JIP-test參數(shù)在主成分坐標系中的分布同樣品聚類分析操作類似，選中所有參數(shù)PC1&PC2得分插入散點圖即可。
詳細操作步驟請查看本試驗下方教程視頻：
n 參數(shù)分布變化——單一處理組JIP-test參數(shù)主成分分布可視化
除將所有處理組共同聚類分析外，如下圖還可將不同處理組JIP-test參數(shù)分布變化進行對比。
1. 在SPSS軟件中將不同處理組樣品參數(shù)分別進行PCA主成分分析。
2. 獲得單一處理組PCA分析結果后，將該組JIP-test參數(shù)“旋轉后的成分矩陣”復制到Excel中。
3. 為獲得每一參數(shù)點箭頭指示連接符，需將各JIP-test參數(shù)在坐標系中的位點轉換為向量值。
4. 在每一參數(shù)上部添加一空白行，并輸入原點"0"。
5. 選中單一參數(shù)數(shù)據(jù)，插入散點圖，分別設置X軸&Y軸坐標為連接原點的向量值。以新系列形式逐一添加所有參數(shù)至散點圖中。
6. 設置箭頭顏色、樣式，隱藏數(shù)據(jù)點，添加系列標簽，標記分簇即可。
單一處理組JIP-test參數(shù)主成分分布可視化詳細操作教程見下方視頻：
結果分析(Result)
通過PCA技術分析發(fā)現(xiàn)，所選的JIP-test參數(shù)形成了三個較好分離的簇。其中兩個位于PC1(Cluster 1&3)上，一個位于PC2(Cluster 2)上。每一組參數(shù)描述了不同的生理過程：光能捕獲和傳遞階段(Cluster 1)、電子傳遞鏈末端性能(Cluster 2)和耗散階段(Cluster 3)。PC1對應PSII活性，較高的值表示更高的PSⅡ性能(低光吸收、高光化學和電子傳輸效率)，代表參數(shù)包括Fv/Fm、PIABS、ABS/RC、DIo/CSm等；PC2則對應PSⅠ活性，較高的值表明PSⅠ性能較高，代表參數(shù)包括φRo、δRo、REo/RC等。
對實驗對照和處理進行聚類分析發(fā)現(xiàn)，對照集中在Cluster1附近，隨著脅迫程度的加深，聚類的位置也在發(fā)生改變：10s處理位于Cluster1和Cluster2之間，30s處理位于Cluster2和Cluster3之間，60s處理位于Cluster3附近。
結合參數(shù)分析，對照表現(xiàn)出較高的PS2性能，10s處理的PS2性能出現(xiàn)受損，30s處理則表現(xiàn)出較低的PS2性能和較高的PSⅠ性能，60s處理的PSⅠ和PSⅡ性能表現(xiàn)最差。
以上分析說明，高溫處理較短時間會損傷PSⅡ的性能，但是PSⅠ的性能會相對提高；時間過長，PSⅠ和PSⅡ性能都會被破壞。
如下兩圖為對照組和高溫處理后，被測參數(shù)主成分分布關系的變化。對照實驗中，Fv/Fm、PIABS、ETo/CSm等光系統(tǒng)PSⅡ性能相關參數(shù)聚集在PC2上；φRo、δRo、REo/CSm等光系統(tǒng)PSI相關參數(shù)則在PC1上；ABS/RC、Mo、Wk三個參數(shù)成簇，位于PC1上；DIo/CSm近乎在原點。
60s高溫處理后，PSⅡ相關參數(shù)轉移到PC1上，PSⅠ相關參數(shù)轉移到PC2上，ABS/RC、Mo與DIo/CSm聚集成簇，Wk轉移到PC2上。
以上變化表明，高溫處理主要影響PSⅡ的性能，ABS/RC、Mo與DIo/CSm則減弱高溫處理的影響，ABS/RC代表光捕獲，Mo代表能量傳遞，DIo/CSm代表耗散，這三個參數(shù)越大，代表樣品的耐熱性越強。
另附上熱處理紫薇OKJIP曲線，詳細制圖方法本文不再詳細介紹，可點擊下面鏈接查看詳細視頻教程。
[研究方法]|PEA植物效率分析儀數(shù)據(jù)處理方法（視頻）
附表1. 熱脅迫JIP-test熒光參數(shù)PCA分析所選參數(shù)
由OJIP曲線直接獲得參數(shù)導出的參數(shù) | |
M0 = (ΔV/Δt)0 = 4(F300μs−F0)/(FM−F0) = TR0/RC−ET0/RC | 瞬態(tài)熒光V=f(t)的近似初始斜率（每毫秒）。該參數(shù)反映了PSⅡ活性反應中心（RCs）的關閉速率。 |
Sm = (AM)/(FM−FO) | 標準化的OJIP曲線上部與坐標軸圍成的面積。該參數(shù)反映了QA的多次更替還原或關閉所有開放的PSⅡ活性反應中心（RCs）所需的激發(fā)能。 |
N = (SM/SS) = SMM0(1/VJ) | 從0點至P點時間內，QA被還原的次數(shù)/周轉數(shù) |
單位PSⅡ活性反應中心（RC）能量比通量（QA還原態(tài)時） | |
ABS/RC = M0(1/VJ)(1/ϕPo) | 單位PSⅡ活性反應中心吸收的能量通量 |
DI0/RC = (ABS/RC)−(TR0/RC) | t=0時，單位PSⅡ活性反應中心熱耗散的能量通量 |
RE0/RC = (1−VI)×(M0/VJ) | t=0時，單位PSⅡ活性反應中心還原PSⅠ末端電子受體的比電子通量 |
單位葉截面積表觀量子通量 | |
ABS/CSm ≈ FM | 達到熒光最大值（t=tFm）時，單位葉截面積吸收的能量，近似等于FM |
TR0/CSm = ϕPo(ABS/CSm) | 達到熒光最大值（t=tFm）時，單位葉截面積捕獲的能量 |
ET0/CSm = ϕЕo(ABS/CSm) | 達到熒光最大值（t=tFm）時，單位葉截面積電子傳遞的能量 |
DI0/CSm=(ABS/CSm) – (TR0/CSm) | 達到熒光最大值（t=tFm）時，單位葉截面積熱耗散的能量 |
RE0/CSm | 達到熒光最大值（t=tFm）時，單位葉截面積還原PSⅠ末端電子受體的比電子通量 |
量子產(chǎn)率或能量通量比 | |
FV/FM = ϕPo ≡ TR0/ABS = [1 – (F0/Fm)] | t=0時，原初光化學反應的最大量子產(chǎn)額，指PSII反應中心捕獲吸收的光子（或激子在天線上遷移）能量的比率 |
FV/F0 = ϕPo/(1 – ϕPo) | 原初光化學反應（電子傳遞至QA-）效率 |
F0/FM = ϕDo ≡ 1 – ϕPo | t=0時，能量耗散的量子效率 |
ϕEo = ET0/ABS = [1 – (FO/FM)] ψ0 = ϕPoψ0 | t=0時，電子從QA-轉移到電子傳遞鏈的量子效率 |
ψ0 ≡ ET0/TR0 = (1 − VJ) | t=0時，PSⅡ活性反應中心捕獲的激子驅動電子傳遞的比率 |
δRo= RE0/ET0 = (1 – VI)/(1 – VJ) | 還原PSⅠ受體測末端電子受體的電子占電子傳遞鏈電子的比率 |
ϕRo = ϕPo ϕEo δRo = RE0/ABS = ϕPo(1 – VI) | 還原PSⅠ受體測末端電子受體的量子產(chǎn)率 |
性能指數(shù) | |
PIabs | 基于吸收的性能指數(shù)：表述了從光子的吸收至電子傳遞鏈的還原的性能指數(shù) |
PItotal | 總性能指數(shù)：表述了從光子吸收至PSI末端電子受體的還原的性能指數(shù) |
驅動力 | |
DFabs | 基于吸收的驅動力：表述了從光子的吸收至電子傳遞鏈的還原的驅動力 |
DFtotal | 總驅動力：表述了從光子吸收至PSI末端電子受體的還原的驅動力 |
特征值 | |
Wk = (Fk – F0 )/(Fj – F0 ) | K點的相對可變熒光，可指示PSII供體側的放氧復合體(OEC)的損傷程度 |
RC/CSm = ϕPo(VJ /M0 )(ABS/CSm) | 達到熒光最大值（t=tFm）時，單位葉截面積活性反應中心的數(shù)量 |
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